FormatieWetenschap

Moleculair genetisch onderzoek methode

Te gaan welke varianten DNA-structuur gebruikt moleculair genetische wijze. Voor elke DNA-gebied, dat dit gebied van het chromosoom, gen of allel onderzoekt de werkwijzen verschillen. Elke onderliggende moleculaire genetische werkwijze omvat een of andere manipulatie van RNA en DNA. Al deze methoden worden gekenmerkt door een enorme complexiteit, zonder laboratorium omstandigheden niet kan worden uitgevoerd, en het personeel moet hoog gekwalificeerd zijn. Deze werkzaamheden worden uitgevoerd in verschillende fasen uitgevoerd.

stadia

Ten eerste RNA of DNA monsters te produceren. Hier kan een moleculair genetische wijze worden toegepast op vrijwel elk materiaal: een druppel bloed, leukocyten, fibroblasten cultuur, mucosa (geschraapte), zelfs de haarzakjes, - DNA kan worden verkregen uit elk monster. Het is geschikt voor elk moleculair genetische methoden en de verschillende opties te gebruiken en hebben langdurige geïsoleerde DNA wordt bevroren opgeslagen. De tweede fase is gewijd aan de accumulatie van het gewenste fragmenten (amplificatie) van DNA, aangezien het verzekert de polymerasekettingreactie in vitro (in vitro zonder tussenkomst van levende organismen). Dientengevolge, het geselecteerde DNA-fragment vermenigvuldigt deze kettingreactie en de hoeveelheid DNA verhogingen letterlijk miljoenen keren.

De derde stap in de moleculair genetische onderzoeksmethoden verondersteld vermenigvuldigde DNA restrictie (dit fragmentatie, scheuren of snijden). Restrictie uitgevoerd door elektroforese op een polyacrylamidegel of agarosegel. Deze moleculaire genetische werkwijze voor het bestuderen van het DNA-fragment kan iedereen een bepaalde positie in de gel te nemen. Daarna wordt de gel behandeld met ethidiumbromide, kunnen binden aan DNA, bestraling met ultraviolet licht, is het mogelijk om luminescentie porties nemen. Moleculair genetische diagnostische methoden zijn gevarieerd en talrijk, maar de eerste twee stappen zijn gemeenschappelijk voor alle. Maar om DNA-fragmenten te identificeren, kan de gel worden gekleurd, en vele andere bestaande werkwijzen.

species

De meest directe en wijdverspreide werkwijzen voor het detecteren van mycobacteriën kunnen de bovengenoemde moleculaire genetische DNA werkvorm omvatten. De essentie is dat, teneinde de scanketen materiaal van specifieke fragmenten van DNA van pathogenen te identificeren. Moleculair genetische diagnostische technieken nog niet over een meer efficiënte manier om dergelijke ziekten te herkennen als tuberculose. Met behulp van de polymerase kettingreactie (PCR), kunt u er zeker van zijn dat het oorspronkelijke DNA het aantal kopieën in een miljoen keer zal toenemen, dat wil zeggen voor versterking, en het zal de resultaten weer te geven. De gevoeligheid is zeer hoog - meer dan vijfennegentig procent, hetgeen het belangrijkste voordeel van deze methode.

De overige moleculaire genetische werkwijzen voor onderzoek naar de effectiviteit van de opbrengst meerdere kopieën letterlijk verdubbeld, omdat in dit geval de opstelling monster een specifieke oligonucleotidesequentie verhoogd tot honderdenzes maal. Zelfs de cultuur diagnose van tuberculose van de luchtwegen aanzienlijk verlagen de gevoeligheid. Dit is de reden waarom de moderne geneeskunde is gebaseerd op moleculair genetische methoden voor de diagnose van tuberculose. Een beschreven methode is in het bijzonder effectief bij de behandeling van ziekteverwekkers van hoge antigene variabiliteit, bepalen dat andere manier is het veel moeilijker - vereist speciale voedingsbodems en het cultiveren van lange tijd. Biochemische en moleculair genetische methoden produceren heel ander effect op de resultaten.

diagnose van tuberculose

Stel PCR diagnose van tuberculose vaakst gebruikt die DNA-sequenties die specifiek zijn voor alle vier typen van de ziekte. Om dit doel te bereiken vaak gebruik van primers die detecteren sequentie-elementen (IS-986, IS-6110), aangezien deze elementen kenmerkend sterk migrerende Mycobacterium tuberculosis en altijd aanwezig meerdere kopieën in het genoom. Ook DNA-extractie uit zuivere kweken en Klinische (sputum van patiënten) volgens elke andere geschikte werkwijze worden uitgevoerd. Zo zijn er Boom methode waarbij de lysisbuffer wordt gebruikt op basis van de guanidine thiocyanaat en silica als drager DNA. Het aantal patiënten dat een slechte bacteriologische neemt elk jaar verschillen, en dus in de klinische praktijk heeft een heel ander niveau van de organisatie die is opgericht: moleculair-genetische methode van de bestudering van DNA speelt een belangrijke rol in de diagnose.

Toch moeten we toegeven dat het is niet zonder nadelen. De PCR-methode is het gebruik van vaak brengt een groot aantal vals-positieve resultaten, en de reden is niet alleen technische fouten, maar ook de kenmerken van de methode zelf. Bovendien, deze methode van diagnose tot de levensvatbaarheid van mycobacteriën, die geïdentificeerd bepalen, is gewoon onmogelijk. Maar dit nadeel is niet het belangrijkste. Moleculair genetische werkwijzen van PCR diagnostische handelingen het gevaar van besmetting van mycobacterieel DNA. Certificatie-eisen om deze reden dat voor PCR laboratoria exclusief ontworpen hard, ze vereisen drie afzonderlijke lokalen. PCR-technologie is modern en zeer complex, het vereist het gebruik van de juiste apparatuur en high-opgeleid personeel.

bacterioscopy

Wanneer de diagnose resultaten van de analyse moeten worden vergeleken met andere gegevens: klinisch onderzoek, radiografie, microscopie, bijsnijden en zelfs antwoord op een specifieke behandeling zijn zeer belangrijk. In deze serie, de PCR studies is slechts één van de componenten. Detecteren de ziekteverwekker in de vroege diagnose kan de eenvoudigste en snelste methoden - bacteriologische.

Er wordt gebruik gemaakt van een lichtmicroscoop (kleuring Ziehl-Neelsen) en fluorescentie (kleurende fluorochromen). Het voordeel is snelheid uitstrijkje resultaten. Maar het nadeel is terecht beschouwd als de beperkte capaciteit vanwege de lage gevoeligheid. Echter, deze methode gegeven aanbeveling van de WHO als de meest economische en de grond om tuberculosepatiënten te detecteren. Detectie van mycobacteriën bacteriologische methode heeft voorspelling waarde en de geschatte kwantitatief bacteriële excretie. Veel meer vertrouwen om te gaan met het moleculair genetisch onderzoek methoden van tuberculose.

Cultures

Betere opsporing van mycobacteriën herkennen culturele studies. Het zaaien van pathologisch materiaal waarvan het is gemaakt in het ei medium: Mordovsky, Finn II, LJ, en dergelijke. Benchmarks van resistentie van mycobacteriën tot geneesmiddelen en indirect bewijs van de effectiviteit van een aantal mycobacteriën en hun kolonies in vitro, als de toegepaste methode van onderzoek cultuur. Om het percentage van de isolatie van mycobacteriën inenting van pathologisch materiaal wordt gehouden op meerdere omgevingen te verhogen.

Voldoen aan de behoeften van een groot aantal culturele, pathogeen waaronder subsidie en vloeistoffen. In dit systeem en geautomatiseerde meting soort VANTES groei. Gewassen moeten incubatie worden gehouden voor maximaal zeven tot acht weken. Tegen die tijd het gewas met het gebrek aan groei negatief kan worden beschouwd. De meest effectieve manier om Mycobacterium tuberculosis te detecteren overwegen biologische monsters: diagnostisch materiaal infect cavia's, die zeer gevoelig zijn voor TB zijn.

enkele cijfers

Interessante vakgebied, die werd geopend door PCR diagnostiek is het M. tuberculosis te bestuderen - latente infectie. Het moderne concept van tuberculose-infectie suggereert dat van de honderd mensen die in contact met M. tuberculosis waren, negentig kan heel goed worden besmet, maar slechts tien van hen zijn actieve ziekte wordt ontwikkeld. Anderen hebben TB immuniteit, en omdat negentig procent van de gevallen de infectie blijft latent. Detect een patroon dat het heeft geholpen een moleculair-genetische methode.

Genetici zeggen dat vijfenvijftig procent van de mensen die hun gewassen pathologisch materiaal negatief, en tachtig procent van de mensen geïnfecteerd met M. tuberculosis, maar stromen zonder radiografische verschijnselen van de ziekte kregen PCR positieve reacties. Het is een genetische diagnostische methode geholpen bij het identificeren van patiënten in gevaar brengen door PCR studies, met de resultaten van hun analyses (microscopie en cultuur) werden negatief en subklinische infectie M. tuberculosis aanwezig was.

modern onderzoek

De Russische Federatie en bacteriologische laboratoria een versnelde werkwijze absolute concentraties: nitraatreductaseactiviteit getest door Griess reagens mycobacteriën. Anti-TB centra maken gebruik van een methode die het mogelijk maakt om resistentie tegen geneesmiddelen te bepalen. Dit enten in vloeibare media, waarbij automatische radiometrische en fluorescerende boekhoudsysteem groei van mycobacteriën. Een dergelijke analyse is snel gedaan - tot twee weken.

Momenteel worden nieuwe methoden ontwikkeld: geneesmiddelen resistentie van mycobacteriën wordt gemeten bij het genotype niveau. Studie van de moleculaire mechanismen van resistentie genen en toont de aanwezigheid van mycobacteriën. Deze genen zijn geassocieerd met resistentie tegen bepaalde geneesmiddelen. Bijvoorbeeld Kasa genen inha, katG bestand tegen isoniazide, rpoB-gen - rifampicine 16SP RNA genen en rpsL - streptomycine, EMB1 - tot ethambutol, gyrA - een fluoroquinolone enzovoort.

mutaties

De moderne diagnose aanzienlijk toegenomen moleculair-genetisch niveau methode voor het bestuderen van DNA en liet grootschalige studies van mutaties uit te voeren in al hun spectrum. Nu weten we dat de meest voorkomende mutaties in de 516, 526 en 531 codons het rpoB-gen, en identificeerde de resistentie tegen verschillende geneesmiddelen. Er is een hele reeks van methoden voor het typeren van mycobacteriën met behulp van niet alleen traditionele methoden - biochemische, biologische en culturele, maar ook op grote schaal gebruikt moderne moleculair genetische technieken. Er al toereikend zijn en de juiste diagnose werkwijze voor de detectie monogene ziekten. Zij zijn gebaseerd op DNA studies op het juiste oppervlakte van een bepaald gen. Dit is meestal een complex proces, tijdrovend en kostbaar, maar de data die wordt verschaft door moleculaire genetische analyse is veel nauwkeuriger en informatief dan de gegevens van alle andere analyses.

Het is al lang bekend dat het DNA niet verandert gedurende de gehele levensduur van het organisme dat het in alle kernhoudende cellen odnakova, en dit maakt het mogelijk om de analyse van absoluut alle cellen van het lichaam te nemen, in elk stadium van de ontogenie. De beschadigde gen kan worden gedetecteerd vóór het verschijnen van de eerste symptomen van de full-scale klinische ziekte, maar ook bij gezonde heterozygote mensen, maar met een mutatie in het gen. Moleculair genetische erfelijke ziekte diagnostische methoden is het mogelijk om de (directe benadering, DNA-diagnostiek) te onthullen, evenals de scheiding van de ziekte te analyseren in de familie met markerloci DNA (genetische polymorfismen), die nauw verbonden zijn met een beschadigd gen (dat wil zeggen, de indirecte benadering van DNA-diagnostiek). Direct of indirect - iedere DNA-diagnostiek is gebaseerd op de werkwijzen voor het identificeren strikt begrensd deel van het menselijk DNA.

directe methoden

Directe methoden van DNA- diagnostiek zijn als de dader gen erfelijke ziekte bekend, ook bekend en soorten zijn mutaties. Bijvoorbeeld, een geschikte directe methoden in een aantal ziekten. Dit chorea van Huntington (uitbreiding CTG-herhalingen), fenylketonurie (R408W), cystic fibrosis (delF508, grote mutaties) en dergelijke. Het belangrijkste voordeel van de directe methode is een volledige dochter-diagnostische nauwkeurigheid, en er is geen noodzaak om een DNA-analyse van de rest van de familie te doen. Indien een mutatie in het overeenkomstige gen wordt gevonden, maakt het precies goed te keuren een diagnose van erfelijkheid, genotype bepaling voor de rest van de belaste familie.

Een ander voordeel van een directe diagnose wordt beschouwd als een heterozygote drager van slechte mutaties van familieleden en ouders die aan de ziekte overleden identificeren. Dit geldt met name voor ziekten autosomaal recessief. Nadelen van directe methoden zijn ook beschikbaar. Toe te passen, moet je precies weten lokaliseren het afwijkende gen, exon-intron structuur van het spectrum en de mutaties. Niet alle monogene ziekten vandaag hebben deze informatie ontvangen. Informatiegehalte directe methoden kan niet volledig worden beschouwd, omdat één en hetzelfde gen een groot aantal pathologische mutatie dat de ontwikkeling van erfelijke ziekten veroorzaakt kunnen hebben.

indirecte methoden

Indirecte methoden in DNA-diagnostiek worden gebruikt op alle, in andere gevallen, als de beschadigde gen niet is geïdentificeerd, maar alleen chromosomaal, of als de lijn diagnose niet het resultaat gaf (het gebeurt, als het gen complexe moleculaire organisatie of een groot deel, als er een heleboel pathologische mutaties). Indirecte methoden uitgevoerd segregatie analyse van polymorfe markers in allelische familie. Markers in hetzelfde chromosomale gebied of locus is nauw verbonden met de ziekte en deleties of inserties, substituties punt, herhalingen voorstellen en hun polymorfisme door verschillende hoeveelheid cellen in het blok.

Meest geschikt is voor indirecte diagnose beschouwd microsatelliet en minisatelliet polymorfismen, die op grote schaal worden verspreid in het menselijk genoom. de waarde in hoog informatiegehalte, op schade aan de genetische afstand tussen de markering en het gen niet te groot is. In het laatste geval wordt de schattingsnauwkeurigheid bepaald in hoge mate de frequentie van recombinatie tussen de polymorfe marker en beschadigingen. Indirecte diagnostische werkwijzen ook verplicht voorafgaande stap van allelfrequenties van de geanalyseerde onderzoekspopulatie onder patiënten en dragers van mutaties plus de noodzaak van het bepalen van de waarschijnlijkheid van recombinatie van evenwichts en adhesie markers en mutante allelen.

andere methoden

Korte segmenten van RNA of DNA, alsmede enkel gen zichtbaar gemaakt onder microscopisch onderzoek kan niet worden derhalve mutaties nodig moleculair genetische diagnose te identificeren. Er is een "Human Genome Project", evenals andere ontwikkelingen in de moleculaire genetica sterk uitgebreid de mogelijkheid om de diagnose van erfelijke ziekten - zowel pre- en postnatale. Deze werkwijzen kunnen vroegtijdige detectie en een voorspelling poly- en monogene aandoeningen, waarvan debuut plaatsvindt in de volwassenheid. Helaas, als gevolg van de technische mogelijkheden van moleculair genetische studies zijn soms buiten de ethische grenzen die zijn ingesteld met betrekking tot de erfenis, vooral wanneer de diagnose is in de adolescentie en jeugd.

Structurele en numerieke chromosomale afwijkingen zijn de meest voorkomende oorzaken van ziekten en kanker, en vele misvormingen. Chromosomale afwijkingen moeten worden geïdentificeerd, wat belangrijk is voor gezinsbegeleiding - de prognose te evalueren, samen met de reproductieve risico's in de toekomst zwangerschappen. Chromosoom analyse is de "gouden standaard" van genetische diagnose, maar het is beperkt. Alleen de methoden van moleculair genetische analyse kan meer doen, omdat er vroeger klonen technologie gebaseerde fluorescerende labels die in staat is hun hoge gevoeligheid voor subtiele chromosomale veranderingen die onmogelijk is om de klassieke sporen identificeren cytogenetische studies. Deze technieken worden steeds meer de uitbreiding van onze diagnostische mogelijkheden, bij onderzoek, kinderen met ontwikkelingsstoornissen, mentale retardatie, met vele andere erfelijke ziektes.

bevindingen

Het is zeer belangrijk voor de mensheid daarna de genstructuur en functie van kennis soorten variabiliteit, de mogelijkheid om erfelijke ziekten die zich in verband met de ontwikkeling van moleculaire genetica detecteren. de werkwijzen zijn gericht op het bestuderen van het DNA molecuul - en wanneer het normaal is, en als het is beschadigd. Bereiding van desoxyribonucleïnezuur sequenties van nucleotiden (DNA) zich stapsgewijs van ontvangen monsters op individuele fragmenten te identificeren. Isolatie van genomisch DNA uit de cellen, restrictie (scheuren), amplificatie (klonen), elektroforese van de fragmenten (scheiden hun elektrische lading en molecuulgewicht door agarose gel). Identificeren van specifieke fragmenten op het oppervlak van een afzonderlijke strook.

Vervolgens krijgen in de handeling speciale filters, waardoorheen elk fragment hybridisatie met gekloneerde DNA-fragmenten of synthetische radioactieve probes een controle, die gelijk is aan elk testmonster wordt. Als de positie of lengteverandering opzichte van de sonde, wanneer een nieuw fragment of verdwenen - dit alles suggereert dat het geanalyseerde gen geherstructureerd in de nucleotidesequentie. Er zijn acht basistechnieken moleculair genetische studies: sequentie (bepaling van DNA-sequentie), polymerase kettingreactie (toename van het aantal sequenties), de bereiding van primers bekende genen, DNA cloning, productie van recombinante moleculen afgeleide eiwitten vanwege recombinante moleculen, waardoor een complete set (collectie library) gekloneerde fragmenten die werden verkregen met restrictie.

Similar articles

 

 

 

 

Trending Now

 

 

 

 

Newest

Copyright © 2018 birmiss.com. Theme powered by WordPress.