Fluorescentie microscopie: principes van de methode

Absorptie en re-emissie van licht verder anorganische en organische vloeistoffen is het resultaat van fosforescentie of fluorescentie. Het verschil tussen de verschijnselen is de duur van het interval tussen absorptie en emissie van licht flux. Wanneer de fluorescentie van deze processen plaats bijna gelijktijdig, terwijl fosforescentie - met enige vertraging.

historische informatie

In 1852, Britse wetenschapper Stokes, eerst beschreven fluorescentie. Hij introduceerde een nieuwe termijn als gevolg van de experimenten met vloeispaat, die rood licht uitzenden onder ultraviolet licht. Stokes noteerde een interessant fenomeen. Het blijkt dat de golflengte van de fluorescentiestraling is altijd groter dan de stroomsnelheid van het excitatielicht.

Om de hypothese in de 19e eeuw bevestigen dat er veel experimenten zijn geweest. Zij toonden aan dat verschillende monsters fluoresceren onder invloed van ultraviolet licht. Tot de materialen, onder andere, zijn kristallen, harsen, mineralen, chlorofyl, ruwe drugs, anorganische stoffen, vitaminen, oliën. Het directe gebruik van kleurstoffen voor biologische proeven begon pas in 1930

Fluorescentiemicroscopie: beschrijving

Een aantal van de in de eerste helft van de 20e eeuw studies materialen tentoongesteld hoge specificiteit. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Dankzij de prestaties, die niet kan worden bereikt door zeer uiteenlopende methoden, heeft de methode van fluorescentie microscopie een essentieel instrument in de biomedische en biologisch onderzoek. Even belangrijk resultaten werden verkregen, en voor materialen.

? Welke voordelen biedt de methode van fluorescentie microscopie? Het gebruik van nieuwe materialen mogelijk is geworden en de selectie van zeer specifieke cel submicroscopische componenten. Fluorescentie microscopie kunnen afzonderlijke moleculen te detecteren. Een verscheidenheid van kleurstoffen de identificatie van meerdere items tegelijk. Ondanks de beperkte ruimtelijke resolutie van de diffractie limiet van het materiaal, die op zijn beurt, afhankelijk van de specifieke eigenschappen van het monster, de identificatie van moleculen onder dit niveau is ook heel goed mogelijk. Verschillende monsters na bestraling autofluorescentie vertonen. Dit verschijnsel wordt veel gebruikt in gesteenten, blad, de halfgeleiderindustrie.

kenmerken

Bestudeer dierlijke weefsels of pathogenen vaak ingewikkeld of te zwak of zeer sterke niet-specifieke autofluorescentie. De waarde in studies verkrijgt inbrengen in de materiaalcomponenten geëxciteerd bij een specifieke golflengte en uitzenden van de benodigde lichtstroom intensiteit. Fluorochromen fungeren als kleurstoffen onafhankelijk kunnen verbonden structuren (zichtbaar of onzichtbaar). Derhalve hebben ze een hoge selectiviteit voor het doelwit en de kwantumopbrengst.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescentie microscopie is op grote schaal gebruikt sinds de komst van natuurlijke en synthetische kleurstoffen. Zij bezaten bepaalde intensiteit profielen van de emissie en excitatie en gericht op specifieke biologische doelwitten.

Identificatie van individuele moleculen

Vaak, in ideale omstandigheden, kunt u een afzonderlijk element gloed te registreren. Hiervoor ondermeer moet een voldoende lage ruis van de detector en het optische achtergrond verschaffen. Fluoresceïne molecule te mislukken als gevolg van fotobleken kan uitzenden tot 300 duizend. Fotonen. Bij 20% inzameling efficiëntie van het proces en kan ze inschrijven in een hoeveelheid van ongeveer 60 duizend.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescentie microscopie op basis van avalanche fotodiodes of elektronische vermenigvuldiging, konden de onderzoekers het gedrag van individuele moleculen te observeren door de tweede, en in sommige gevallen zelfs minuten.

ingewikkeldheid

Een belangrijk punt in het voordeel van de onderdrukking van de optische ruis achtergrond. Vanwege het feit dat veel van de gebruikte in het ontwerp van filters en lenzen vertonen sommige autofluorescentie materialen, de inspanningen van wetenschappers in een vroeg stadium werden gericht op de productie van componenten met een lage fluorescentie. Echter, latere experimenten geleid tot nieuwe conclusies. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. In het bijzonder werd gevonden dat fluorescentiemicroscopie, gebaseerd op totale interne reflectie, het mogelijk om een lage achtergrond en hoge intensiteit excitatielicht bereiken.

mechanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. De principes van fluorescentiemicroscopie, op basis van totale inwendige reflectie is het gebruik van uitdovende golf of verdwijnende. Deze aan het grensvlak tussen media met verschillende brekingsindices. In dit geval wordt de lichtbundel door het prisma. Het heeft een hoge brekingsindex parameter.

Het prisma grenst aan de waterige oplossing of glas met een lage parameter. Als een lichtstraal gericht op het op een hoek die kritischer wordt de lichtstraal gereflecteerd door het grensvlak. Dit verschijnsel veroorzaakt weer nonpropagating golven. Met andere woorden, de opgewekte elektromagnetische veld dat doordringt in een medium met een lagere brekingsindex parameter op een afstand kleiner dan 200 nanometer.

De uitdovende golf intensiteit van het licht zou volstaan om fluoroforen prikkelen. Echter, vanwege de extreem geringe diepte, het volume zal zeer klein zijn. Het resultaat is een low-level achtergrond.

wijziging

Fluorescentie microscopie is gebaseerd op de totale interne reflectie, kan worden uitgevoerd met een epi-verlichting. Dit vereist lenzen met een hoge numerieke apertuur (ten minste 1,4, maar het is wenselijk dat het bereikte 1,45-1,6 is), en gedeeltelijk belichte veld inrichting. Dit laatste wordt bereikt met een kleine spotgrootte. Meer eenvormigheid behulp van een dunne ring, die wordt geblokkeerd door een gedeelte van de stroom. Voor de kritische hoek, waarna er een totale reflectie, hebben we een hoge breking van het immersiemedium de lens en het dekglas van de microscoop.